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幾種常見的拉曼技術

共振拉曼(RRS)

如果激光的波長和分子的電子吸收相吻合，這一分子的某個或幾個特征拉曼譜帶強度將增至100-10,000 倍以上，并觀察到正常拉曼效應中難以出現的、其強度可與基頻相比擬的泛音及組合振動光譜。這種共振增強或共振拉曼效應非常有用，不僅能顯著降低檢測限，而且可引入電子選擇性。由于共振拉曼能提供結構及電子等信息，因此，共振拉曼也被用于物質鑒定。

紫外共振拉曼(UVRRS)

熒光干擾問題和靈敏度較低嚴重阻礙了常規拉曼光譜的廣泛應用。但近年來發展起來的紫外拉曼光譜技術有效地解決了上述問題。紫外拉曼光譜技術的出現和發展大大地擴展了拉曼光譜的應用范圍。右圖是紫外拉曼光譜避開熒光干擾的原理圖。熒光往往出現在300 nm-700 nm 區域，或者更長波長區域。而在紫外區的某個波長以下，熒光少出現。因此，對于許多在可見拉曼光譜中存在強熒光干擾的物質，例如氧化物、積碳等， 通過利用紫外拉曼光譜技術就可以成功的避開熒光從而得到信噪比較高的拉曼譜圖。從下圖磷酸鋁分子篩ALPO-5 示例可以看出，紫外共振拉曼光譜技術由于能避開熒光，可以成功用于微孔和介孔分子篩材料的表征。

紫外拉曼光譜技術的另一個突出特點是，拉曼信號可以通過共振拉曼信號得到增強。共振拉曼效應可以從拉曼散射截面公式得到解釋：根據Kramers-Heisenberg-Dirac 散射公式:

在公式 (1) 中，ωri 是初始態i 到激發態r 的能量差頻率，ωL 是入射激光頻率。當激發光源頻率靠近電子吸收帶時，*項分母趨近于零，因而其散射截面異常增大, 導致某些特定的拉曼散射強度增加104~106 倍。共振拉曼光譜的譜峰強度隨著激發線的不同而呈現出與普通拉曼不同的變化。

紫外拉曼光譜規避熒光成功表征AIPO-5 分子篩的信號

將紫外共振拉曼用于表征多組份體系時，可以選擇性的激發某些組分相應的信息，從而使與這些組分相關的拉曼信號大大增強，得到共振拉曼光譜

這種共振增強或者共振拉曼效應是非常有用的一個技術，它不僅可以大的降低拉曼測量的探測限，而且還可以引入到電子選擇上面。這樣，如果我們使用共振拉曼技術來研究樣品，不僅可以看到它的結構特征，而且還可以得到它的電子結構信息。金屬卟啉， 類胡蘿卜素以及其他一系列生物重要分子的電子能級之間躍遷能量差都處在可見光范圍之內，這使得它們成了共振拉曼光譜的理想研究材料。

拉曼散射和共振拉曼散射的能級圖以及它們對應拉曼譜圖示意圖

共振選擇技術還有一個非常實際的應用。那就是二分之一載色體的光譜由于這種共振作用會得到增強，而它周圍的環境則不會。對于生物染色體來說這就意味著，我們使用可見光即可特定的探測到有源吸收中心，而它們周圍的蛋白質陣列則不會對探測產生影響（這是因為這些蛋白質需要紫外光才能使其產生共振增強作用）。共振拉曼光譜在化學上探測金屬中心合成物，富勒分子，聯乙醯以及其他的稀有分子上也是一種重要的技術，因為這些材料對于可見光都有著很強的吸收。

其他更多的分子吸收光譜由于處于紫外，所以需要紫外激光進行共振激發，我們就稱之為紫外共振拉曼（Ultra Violet Resonance Raman Spectroscopy）; 紫外共振拉曼光譜技術是研究催化和復雜生物系統中分子分析的一個重要工具。大多數的生物系統都吸收紫外輻射， 所以它們都能提供紫外的共振拉曼增強。這樣高的共振拉曼共振選擇效應使得像蛋白質和DNA 等重要生物目標的拉曼光譜得到大增強， 而其他物質則不會，非常便于目標確認及分析。例如，200nm 的激發光能夠增強氨基化合物的振動峰；而220nm 的激發光則可以增強特定的芳香族殘留物的振動峰。水中的拉曼散射非常弱，這個技術使得與水有關的微弱系統的拉曼分析也變成了可能。

金屬卟啉、類胡蘿卜素以及其他幾類重要的生物分子在可見光區域內有強烈的電子躍遷，因此他們成了理想的共振拉曼光譜檢測對象。

表面增強拉曼（SERS）

自1974 年Fleischmann 等人發現吸附在粗糙化的Ag 電表現的吡啶分子具有巨大的拉曼散射現象，加之活性載體表面選擇吸附分子對熒光發射的抑制，激光拉曼光譜分析的信噪比大大提高，這種表面增強效應被稱為表面增強拉曼散射(SERS)。

拉曼散射由化合物（或離子）的散射吸附，或在結構化金屬表面，可達到溶液中散射的103 倍到106 倍。這種表面增強拉曼散射在銀表面表現得zui強，在金或銅表面也比較強。其他金屬則沒有這么強的增強效應。

表面增強效應產生的兩個機制：

*種是在貴金屬表面產生一種增強的電磁場。當入射光的波長接近金屬等離子體波長時，金屬表面傳導電子被激發到一個擴展表面的電子激發態，稱為表面等離子體共振。分子吸附在表面或接近表面經過一個異常大的電磁場。垂直于表面的振動模式帶來的增強zui強烈。

第二種是是在表面和分析物分子之間形成電荷轉移絡合物。許多電荷轉移絡合物帶來的電子躍遷會產生可見光，以便發生增強諧振。

顯微共聚焦拉曼（Confocal）

共焦：從一個點光源發射的探測光通過透鏡聚焦到被觀測物體上，如果物體恰在焦點上，那么反射光通過原透鏡應當匯聚回到光源， 這就是所謂的共聚焦，簡稱共焦。共焦指的是空間濾波的能力和控制被分析樣品的體積的能力，通常是利用顯微鏡系統來實現的。只有顯微鏡系統的無限遠光路才可以實現良好的共焦性能。

顯微拉曼光譜技術是將拉曼光譜分析技術與顯微分析技術結合起來的一種應用技術。與其他傳統技術相比，更易于直接獲得大量有價值信息，共聚焦顯微拉曼光譜不僅具有常規拉曼光譜的特點，還有自己的*優勢，樣品區接近衍射限（約1 微米）；成像和光譜可以被組合以產生“拉曼立方體”三維數據，在二維圖像的每個像素對應一個拉曼頻譜信息。

從光學結構來說，顯微共聚焦拉曼光譜儀主要有針孔共聚焦和“狹縫-CCD”共聚焦兩種設計結構。

先進的“狹縫+CCD 焦平面共焦”技術，具有較高通光效率，高靈敏度，操作簡單。

原理：顯微鏡頭聚焦到樣品上，將顯微鏡頭收集的樣品信號聚焦到光譜儀狹縫入口，通過狹縫對焦平面的一維（X 方向）限制進入光譜儀； 經光譜儀分光，光譜成像在CCD 上；在通過對CCD 上像元的提取， 對另一維（Y 方向）的信號的限制，提取出樣品上的信號，實現共焦作用。“狹縫+CCD 焦平面共焦”技術特點：

1、 共焦區域任意設置（狹縫寬度，CCD 像元區域任意設定）。

2、 全部信號進入光譜儀，沒有信號損失。

采用“狹縫+CCD焦平面共焦”技術的Finder Vista（“微曼”共聚焦拉曼顯微鏡）空間分辨率指標：

 X，Y方向空間分辨率：1um

 Z方向空間分辨：2um